Ученые выяснили степень активности действия амилазы

Полые сведение на тему: "Ученые выяснили степень активности действия амилазы" с подробным описанием понятным языком. Если у вас возникли вопросы, то вы всегда можете обратиться к дежурному юристу.

Влияние рН и температуры на активность ферментов.

Для ферментов характерен температурный оптимум

20…40 0 С. В интервале от 0 до 40…50 0 С скорость ферментативных реакций при повышении температуры на 10 0 С возрастает в 2 раза в соответствии с правилом Вант-Гофа. При температуре свыше 60 0 С скорость ферментативной реакции снижается. При 80…100 0 С фермент инактивируется, теряет биологическую активность.

Термолабильность ферментов объясняется тем, что ферменты являются белками. При температуре свыше 80 0 С происходит тепловая необратимая денатурация фермента. Есть и исключения: фермент каталаза проявляет максимальную активность при 0 0 С, фермент мышц миокиназа — при 100 0 С.

Для ферментов характерен физиологический оптимум рН (табл. 11).

Фермент Оптимум рН Субстрат
Пепсин 1.5-2,5 Белки
Трипсин 7,8 Белки
Уреаза 6,4-6,9 Мочевина
a-Амилаза слюны 6,9 Крахмал
Аргиназа 9,5-9,9 Аргинин
Липаза (панкреатическая) 7,0-8,5 Жиры
Мальтаза (кишечная) 6,1 Мальтоза
Сахараза (кишечная) 6,2 Сахароза
a-Амилаза (панкреатическая) 6,7-7,2 Крахмал

Термостат; пробирки; баня водяная; крахмал (1%-й раствор); кислота соляная (0,1 н раствор); раствор Люголя (раствор йода в йодиде калия).

Порядок выполнения работы:

Ферментом, расщепляющим крахмал, является амилаза (фермент слюны). Оптимум рН для амилазы 6,9-7,0.

Гидролиз крахмала под действием амилазы проходит следующие стадии образования декстринов:

Крахмал + J2 Амилодекстрины

Амилодекстрины + J2 Эритродекстрины

Эритродекстрины + J2 Ахродекстрины

Ахродекстрины + J2 Мальтоза

Мальтаза + J2 желтое окрашивание.

В три пробирки наливают по 5 сл свежеприготовленного 1%-го раствора крахмала. В пробирки 1 и 2 добавляют по 1 мл воды, в пробирку 3 — 1 мл 0,1 н раствора соляной кислоты (происходит сдвиг рН в кислую область). В пробирки 1 и 3 добавляют по 1 мл разбавленной слюны (активной амилазы), в пробирку 2 — 1 мл прокипяченной слюны. Содержимое пробирок перемешивают, ставят пробирки в термостат при температуре 37 0 С на 10 мин. Пробирки охлаждают и добавляют в каждую по две капли раствора Люголя.

Делают выводы о зависимости активности амилазы от рН и температуры

(по глубине гидролиза крахмала, окраске продукта гидролиза).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Только сон приблежает студента к концу лекции. А чужой храп его отдаляет. 9023 — | 7674 — или читать все.

185.189.13.12 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

Источник: http://studopedia.ru/12_86464_vliyanie-rn-i-temperaturi-na-aktivnost-fermentov.html

Лабораторные исследования

Исследование изменения активности амилазы.

Определение степени активности амилазы слюны.

(Определенное количество крахмала, расщепляемое 1мл слюны за определённый промежуток времени (30мин)).

Цель работы: выяснить закономерность изменения активности амилазы в период применения биологически активной добавки Биокурунг.

Гипотеза: активность амилазы будет возрастать в течение времени приема препарата пропорционально возростанию рН слюны.

Приборы и материалы:

2)1 штатив для пробирок

3)1% крахмальный клейстер

Для определения степени активности амилазы:

1. Налили из пипетки в десять пронумерованных пробирок по 1 мл дистиллированной воды.

2. Добавили в первую пробирку с помощью пипетки 1 мл слюны, разведенной в 10 раз водой.

3. Перемешали содержимое первой пробирки при помощи троекратного втягивания пипеткой жидкости из пробирки и последующего выливания из пипетки, а затем переносим 1 мл полученной смеси из первой пробирки во вторую.

4. Перемешали таким же образом содержимое второй пробирки и перенесли 1мл полученной смеси из второй пробирки в третью и т. д. Из десятой пробирки 1 мл жидкости как излишний вылили и в итоге получили различное разведение фермента: каждая последующая пробирка содержит фермента в два раза меньше, чем предыдущая пробирка.

5. Налили во все десять пробирок еще по 1 мл дистиллированной воды.

6. Далее, налили из пипетки во все десять пробирок (начиная с десятой, потом в девятую и т.д.) по 2 мл 0,1 % раствора крахмала и перемешали содержимое каждой пробирки.

7. Одновременно поместили все десять пробирок в нагретую до 37º водяную баню.

8. Через 30 минут вынули пробирки из бани, быстро охладили их током холодной воды, перемешали содержимое каждой пробирки и поставили по порядку в штатив.

9. Налили в каждую пробирку по две капли раствора йода, перемешали и наблюдали в пробирках гамму цветов от желтого цвета к синему. Желтый цвет свидетельствует об отсутствии крахмала, красноватый – о присутствии промежуточных продуктов расщепления – декстринов, синий – о присутствии крахмала или продуктов его начального расщепления.

10. Вычислили амилазную активность исследуемой слюны. При этом исходили из следующего. В пробирке, где жидкость окрашена еще в синий цвет, должного расщепления крахмала не произошло. Достаточное расщепление крахмала, очевидно, имеет место в той пробирке, где нет синего оттенка. Пусть, например, это будет пятая пробирка (в шестой пробирке уже имеется синий оттенок). В пятой пробирке неразведенной слюны было 1/320 мл, т.е. мы можем написать:

1/320 мл слюны расщепляет 2 мл 0,1% раствора крахмала

т. е. Х = 2 • 1 / 1/320 = 640.

Таким образом, 1 мл неразбавленной слюны расщепляет за 30 минут при температуре 37º 640 мл 0,1% раствора крахмала.

Таблица для оценки активности амилазы.

Источник: http://studfile.net/preview/2766633/page:3/

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ СЛЮНЫ

БИОЛОГИЯ И ФИТОДИЗАЙН

Занятие 3. Тема: Ферменты, их свойства. Классификация и номенклатура ферментов.

Цель занятия: изучить классификацию и свойства ферментов.

знать:

ü строение ферментов;

ü классификацию ферментов;

ü уравнение Михаэлиса-Ментен, условия его выполнения и способы линеаризации;

ü три типа ингибирования ферментативной активности.

уметь:

ü объяснять химические свойства ферментов, их активаторов и ингибиторов;

ü определять тип ферментативного ингибирования по форме графика скорости ферментативной реакции.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

Строение и свойства ферментов: термолабильность, зависимость активности от значения рН среды, ионной силы раствора, специфичность, влияние на ферменты активаторов и ингибиторов. Конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное ингибирование ферментов. Уравнение Михаэлиса-Ментен.

Номенклатура ферментов. Научная (Московская, 1961 г.) номенклатура. Систематические и рабочие (тривиальные) названия ферментов. Шифры ферментов.

Читайте так же:  Заявление о взыскании алиментов подается

Классификация ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы (синтетазы). Характеристика основных подклассов и подподклассов перечисленных классов.

Литература для самоподготовки:

1. Лекционный курс

2. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М.: Агар, 1999. С. 95-147.

Лабораторная работа: изучение свойств ферментов.

Литература для самоподготовки:

Филиппович Ю.Б.Практикум по общей биохимии. – М.: Просвещение, 1982. С. 80-85.

Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия. – М.: Дрофа, 2004. С. 59-92.

Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 2003. – С. 128-162.

Лабораторная работа к занятию 3. Тема: ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ СЛЮНЫ

Амилазную активность слюны выражают в количестве субстрата (крахмала), расщепляемого 1 мл слюны за определенный промежуток времени (30 мин). Определение основано на нахождении максимального разведения, при котором слюна еще расщепляет крахмал полностью за взятый промежуток времени. О наличии или отсутствии крахмала в растворе судят по йодной реакции.

Оборудование и реактивы: р-р I+KI, 0,1%-ный р-р крахмала, пробирки, штативы, пипетки, стаканчики на 50 мл, фарфоровые чашечки, водяные бани, стаканы, электроплитки, термометры.

1. Наливают в 8 пронумерованных пробирок по 1 мл дистиллированной воды.

2. В первую пробирку отливают 1 мл слюны, разведенной водой в 10 раз. Для получения слюны, разведенной в 10 раз, необходимо 20 мл воды подержать во рту 2 мин.

3. Перемешивают содержимое первой пробирки путем втягивания пипеткой жидкости из пробирки и последующего выпускания из пипетки.

4. Переносят 1 мл из первой пробирки во вторую.

5. Перемешивают содержимое второй пробирки, переносят 1 мл из второй пробирки в третью и т.д. до восьмой пробирки. Из восьмой пробирки 1 мл жидкости выливают. Таким образом, получают ряд разведений.

6. Наливают во все 8 пробирок по 1 мл дистиллированной воды.

7. Наливают во все пробирки, начиная с восьмой, по 2 мл 0,1% -го раствора крахмала и перемешивают содержимое каждой пробирки.

8. Одновременно помещают все 8 пробирок в нагретую до 37 °C водяную баню.

9. Через 30 мин пробирки вынимают и охлаждают током холодной воды. В штатив ставят по порядку номеров.

10. Приливают в каждую пробирку по 2 капли йода. Желтый цвет в пробирках свидетельствует об отсутствии крахмала, красно-бурый – о присутствии промежуточных продуктов расщепления, синий – о наличии крахмала.

11. Вычисляют амилазную активность исследуемой слюны; достаточное расщепление крахмала имеет место в той пробирке, где нет синего оттенка. Для примера, пусть это будет 5-я пробирка. В 5-й пробирке неразведенной слюны было 1/320 мл, т.е. можно записать: 1/320 мл слюны расщепляет 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала. 1 мл слюны расщепляет x мл 0,1%-ного раствора крахмала. Х= 2 / (1/320) = 640. Следовательно, 1 мл неразбавленной слюны за 30 мин при 37 °С расщепляет 640 мл 0,1%-ного раствора крахмала.

ВЛИЯНИЕ рН НА ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН ОПТИМУМА ДЕЙСТВИЯ АМИЛАЗЫ

Ферменты очень чувствительны к изменению кислотности среды, в которой они действуют. Можно считать, что для каждого фермента имеется определенная концентрация протонов, при которой он наиболее активен. Изменение кислотности среды в ту или иную сторону от оптимума рН вызывает понижение активности фермента.

Оборудование и реактивы: 0.1 М р-р лимонной кислоты, 0.2 М р-р Na2HPO4×2H2O, 30% р‑р H2SO4, р-р I+KI, 0,1% и 1%-ный р-р крахмала, индикаторная бумага универсальная, пробирки, штативы, пипетки на 2 и 5 мл, стаканчики на 50 мл, цилиндры на 25 и 50 мл, фарфоровые чашечки, водяные бани, стаканы, электроплитки, термометры.

1. В стаканчиках на 50 мл готовят буферные растворы в соответствии с данными таблицы. Определяют рН растворов с помощью индикаторной бумаги.

2. Берут 5 пробирок, в каждую приливают по 2 мл буферных растворов, 2 мл 1%-ного раствора крахмала, 2 мл слюны, разведенной в 20 раз.

3.Содержимое каждой пробирки перемешивают и оставляют стоять на 10-15 мин. Время ориентировочное. Необходимо контролировать ход гидролиза через каждые 5 мин. Для этого из пробирки с рН 6.8 берут на фарфоровую чашечку 1 каплю жидкости и проводят реакцию с йодом. Опыт лучше прекращать при неполном расщеплении крахмала (красноватая окраска продуктов реакции). Для прекращения опыта во все пробирки добавляют по 2 капли йода. На основании полученной в пробирках окраски судят о степени расщепления крахмала в зависимости от рН. Там, где крахмал расщепляется наиболее полно, было оптимальное значение рН для действия амилазы.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Да какие ж вы математики, если запаролиться нормально не можете. 8601 — | 7446 — или читать все.

Источник: http://studopedia.ru/12_109820_opredelenie-amilaznoy-aktivnosti-slyuni.html

Лабораторные исследования

Исследование изменения активности амилазы.

Определение степени активности амилазы слюны.

(Определенное количество крахмала, расщепляемое 1мл слюны за определённый промежуток времени (30мин)).

Цель работы: выяснить закономерность изменения активности амилазы в период применения биологически активной добавки Биокурунг.

Гипотеза: активность амилазы будет возрастать в течение времени приема препарата пропорционально возростанию рН слюны.

Приборы и материалы:

2)1 штатив для пробирок

3)1% крахмальный клейстер

Для определения степени активности амилазы:

1. Налили из пипетки в десять пронумерованных пробирок по 1 мл дистиллированной воды.

2. Добавили в первую пробирку с помощью пипетки 1 мл слюны, разведенной в 10 раз водой.

3. Перемешали содержимое первой пробирки при помощи троекратного втягивания пипеткой жидкости из пробирки и последующего выливания из пипетки, а затем переносим 1 мл полученной смеси из первой пробирки во вторую.

4. Перемешали таким же образом содержимое второй пробирки и перенесли 1мл полученной смеси из второй пробирки в третью и т. д. Из десятой пробирки 1 мл жидкости как излишний вылили и в итоге получили различное разведение фермента: каждая последующая пробирка содержит фермента в два раза меньше, чем предыдущая пробирка.

5. Налили во все десять пробирок еще по 1 мл дистиллированной воды.

6. Далее, налили из пипетки во все десять пробирок (начиная с десятой, потом в девятую и т.д.) по 2 мл 0,1 % раствора крахмала и перемешали содержимое каждой пробирки.

7. Одновременно поместили все десять пробирок в нагретую до 37º водяную баню.

8. Через 30 минут вынули пробирки из бани, быстро охладили их током холодной воды, перемешали содержимое каждой пробирки и поставили по порядку в штатив.

Читайте так же:  Задолбали коллекторы звонками

9. Налили в каждую пробирку по две капли раствора йода, перемешали и наблюдали в пробирках гамму цветов от желтого цвета к синему. Желтый цвет свидетельствует об отсутствии крахмала, красноватый – о присутствии промежуточных продуктов расщепления – декстринов, синий – о присутствии крахмала или продуктов его начального расщепления.

10. Вычислили амилазную активность исследуемой слюны. При этом исходили из следующего. В пробирке, где жидкость окрашена еще в синий цвет, должного расщепления крахмала не произошло. Достаточное расщепление крахмала, очевидно, имеет место в той пробирке, где нет синего оттенка. Пусть, например, это будет пятая пробирка (в шестой пробирке уже имеется синий оттенок). В пятой пробирке неразведенной слюны было 1/320 мл, т.е. мы можем написать:

1/320 мл слюны расщепляет 2 мл 0,1% раствора крахмала

т. е. Х = 2 • 1 / 1/320 = 640.

Таким образом, 1 мл неразбавленной слюны расщепляет за 30 минут при температуре 37º 640 мл 0,1% раствора крахмала.

Таблица для оценки активности амилазы.

Источник: http://studfile.net/preview/2766632/page:3/

Определение активности амилазы

Амилаза катализирует 1,4- гликозидные связи крахмала, гликогена и родственных им полисахаридов до мальтозы, декстринов и других полимеров. У человека амилаза секретируется поджелудочной и слюнными железами, небольшая ее активность обнаруживается в тканях печени и скелетной мускулатуры. Молекулярная масса ее низкая, равна 48 000 Да, в отличие от большинства ферментов она фильтруется в клубочках почек и содержится в моче. Амилаза состоит из двух изоферментов: панкреатического и слюнного. У здоровых людей в сыворотке крови около 70% амилолитической активности приходится на слюнной изофермент, в моче приблизительно такой же процент приходится на панкреатическую изоамилазу.

Гиперамилаземия наблюдается при многих заболеваниях, но наиболее выражена при остром панкреатите, при котором активность увеличивается за счет панкреатического изофермента. При данном заболевании наибольший подъем содержания амилазы в крови отмечается в первые сутки.

В качестве субстрата в методах определения амилазы чаще применяют крахмал. Крахмал — полисахарид, состоящий из 10-20% из амилозы и амилопектина, нерастворимого в воде. Активность фермента возрастает в присутствии ионов хлора.. в молекулу амилазы входит атом кальция. Ионы кальция не только активируют амилазу, но и предохраняют ее от потери активности и распада под влиянием протеолитических ферментов.

Видео (кликните для воспроизведения).

Ингибирование активности амилазы фторидами, цитратом, оксалатом и ЭДТА объясняется связыванием ионов кальция. Унифицированным методом является метод Смита-Роя и Каравея.

Принцип метода:

амилаза гидролизует расщепление крахмала с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.

Реактивы:

1. Бензойная кислота.

2. Натрия фосфат двузамещенный безводный (Na2HРО4).

3. Крахмал растворимый.

4. Натрия хлорид, 0,154 моль/л.

5. Субстратно-буферный раствор рН 7,0: 13,3 г Na2HРО4 и 2 г бензойной кислоты растворяют в 250 мл 0,154 моль/л хлорида натрия и доводят до кипения. Суспендируют 0,2 г растворимого крахмала в небольшом количестве холодной воды и вводят в кипящий буферный раствор. Кипятят 1 мин. Охлаждают и доводят водой до 500 мл.

7. Калий йодноватокислый.

9. НCI концентрированная.

10. 0,01 Н раствор йода: 0,036 г йодноватокислого калия и 0, 45 г йодида калия растворяют в 40 мл воды и медленно при помешивании добавляют 0,09 мл концентрированной НСI. 5 г фторида калия растворяют в 50 мл воды, фильтруют в мерную колбу, приливают 40 мл раствора йода и доливают водой до 100 мл.

Ход определения:

Опытная проба: 0, 5 мл субстратно-буферного раствора помещают в пробирку, нагревают 5 минут при 37 °С, добавляют 0,01 мл сыворотки. Инкубируют 7,5 мин при 37 °С. После инкубации добавляют 0,5 мл 0,1 н раствора йода и доводят объем водой до 5 мл. Измеряют на ФЭК в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) против воды.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, сыворотку добавляют после инкубации вместе с 0, 1 н раствором йода. Измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу, против воды.

Активность амилазы выражают в миллиграммах или граммах крахмала, гидролизованного 1 л биологической жидкости за 1 с инкубации при 37 °С. Расчет производят по формуле:

Активность амилазы, мг/с.л. = Е1 — Е2,

где Е1 – экстинкция холостой пробы,

Е2 — экстинкция опытной пробы,

С- количество крахмала, введенного в опытную и холостую пробы,

t – коэффициент пересчета на 1 с инкубации,

К – коэффициент пересчета на 1 л биологической жидкости с учетом разведения.

Нормальные величины. Сыворотка крови: 3,3-8,9 мг/с.л или 120 мг/ч.мл.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: На стипендию можно купить что-нибудь, но не больше. 9201 — | 7333 — или читать все.

185.189.13.12 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

Источник: http://studopedia.ru/13_95012_opredelenie-aktivnosti-amilazi.html

Ивановская государственная медицинская академия

Занятие № 2

Тема: СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ. КАЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ИХ ДЕЙСТВИЯ

Вопросы для подготовки

  1. Ферменты. Определение. Значение ферментов в организме.
  2. Структура ферментов. Кофакторы и их характеристика.
  3. Свойства ферментов, сходные со свойствами минеральных катализаторов.
  4. Структура активного центра простых и сложных ферментов:

4.1. Якорный (контактный)участок: структура и функции;

4.2. Каталитический участок: структура и функция

  1. Механизм действия ферментов. Понятие об энергетическом барьере и энергии активации.
  2. Специфические свойства ферментов:

6.1. Зависимость активности ферментов от температуры;

6.2.Зависимость активности ферментов от реакции среды;

  1. Активаторы ферментов. Виды активации. Механизмы, примеры.
  2. Ингибиторы ферментов. Виды ингибирования. Механизмы, примеры
  3. Современная классификация и номенклатура ферментов. Характеристика ферментов каждого класса.
  4. Качественные методы оценки действия ферментов.

11.Внутриклеточная локализация ферментов.

Практическая часть

Изучение влияния различных факторов на активность ферментов.

Протокол № 2

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ

α – АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ.

Цель работы: доказать влияние температуры, рН среды, активаторов и ингибиторов на активность a-амилазы слюны, исследовать специфичность её действия.

Читайте так же:  Виды дисциплинарной ответственности должностных лиц

Методы: 1.Ферментативный гидролиз крахмала под действием a-амилазы слюны в присутствии различных факторов.

2. Иодная проба (проба Люголя).

3 .Проба Фелинга.

Принцип методов и теоретическое обоснование практических работ:

  1. a-амилаза слюны катализирует гидролиз внутренних a-1,4-гликозидных связей крахмала и гликогена с образованием промежуточных (декстрины) и конечных продуктов (мальтоза, изомальтоза и глюкоза).

О проявлении ферментативной активности a-амилазы слюны свидетельствуют:

а) исчезновение субстрата (крахмала), обнаруживаемое с помощью йодной пробы (пробы Люголя). Нерасщепленный крахмал дает с йодом синее окрашивание, амилодекстрины — фиолетовое, эритродекстрины — красно-бурое, ахродекстрины и конечные продукты гидролиза — желтое (цвет йода в воде, т.е. окрашивания не дают).

б) появление продуктов гидролиза — мальтозы, изомальтозы, глюкозы, обнаруживаемое с помощью пробы Фелинга. В основе этой пробы лежит окислительно-восстановительная реакция между глюкозой (мальтозой, изомальтозой или любым другим углеводом, имеющим свободный полуацетальный гидроксил) и ионами Сu2+ (голубого цвета), входящими в состав реактива Фелинга. Углевод за счет свободного полуацетального гидроксила окисляется до соответствующей кислоты (глюконовой, мальтобионовой и т.п.), а Cu2+ восстанавливается до Cu1+ (оранжевого цвета). Реакция идет при нагревании до 100оС.

  1. Наибольшая активность a-амилазы слюны наблюдается при температуре 38-40оС. Этот интервал называется температурным оптимумом фермента. При кипячении слюны вследствие тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к изменению конформации и активного центра, происходит прекращение ферментативной реакции, о чем свидетельствует положительная йодная проба.
  2. Оптимум рН для амилазы слюны можно определить, анализируя результаты ее взаимодействия с крахмалом при различных значениях рН среды. Изменение концентрации протонов приводит к изменению степени диссоциации карбоксильных и аминогрупп и третичной структуры фермента и следовательно, и заряда в якорном участке активного центра. Изменение конформации и заряда молекулы фермента, затрагивающие активный центр, обусловливают понижение ее активности.
  3. Активаторы и ингибиторы влияют на активный центр фермента, способствуя его формированию (NaCl) или разрушению в результате денатурации (CuSO4).
  4. a-амилаза гидролизует полисахариды до конечных продуктов (мальтоза, изомальтоза, глюкоза), но не оказывает никакого действия на дисахариды (сахароза, лактоза, мальтоза, изомальтоза).

3.1. Исследование влияния температуры на активность α-амилазы

Источник: http://isma.ivanovo.ru/articles/2802

Ученые выяснили степень активности действия амилазы

Цель работы — изучить свойства ферментов и особенности протекания биохимических реакций под действием ферментов.

Опыт 1. Ферментативный гидролиз крахмала

С помощью гидролиза изучают состав веществ. Гидролиз может быть: 1) кислотным, 2) щелочным, 3) ферментативным. В первых двух случаях процесс идет при повышенной температуре, а в последнем — при температуре тела человека.

Ферментом, гидролизующим крахмал на составные части (декстрины, мальтозу, глюкозу), является амилаза слюны. Оценку результатов опыта проводят с помощью цветных реакций: Троммера и йодокрахмальной.

Негидролизованный крахмал дает синее окрашивание с раствором йода (I2) (положительная реакция) и отрицательную реакцию Троммера, так как он не обладает восстанавливающей способностью.

Продукты же гидролиза крахмала (мальтоза и глюкоза) не реагируют с раствором йода (отрицательная реакция), но вступают в реакцию Троммера (положительная реакция).

Берут две чистые, сухие пробирки, нумеруют их. В обе пробирки вносят по 10 капель 1 % раствора крахмала. В одну из них добавляют 4 капли воды (контроль), а во вторую — 4 капли раствора слюны в разведении 1:5. Перемешивают и ставят в термостат на 15 минут при 37 °С.

Затем проверяют, прошел ли гидролиз крахмала в каждой из пробирок. Для этого из первой пробирки дважды отбирают по 4 капли исследуемого вещества, вносят их в две новые пробирки и проводят в этих пробирках, соответственно, две реакции: йодокрахмальную в одной и реакцию Троммера в другой.

Аналогичную процедуру выполняют с содержимым второй пробирки. При подготовке отчета результаты опыта заносят в таблицу, построенную по образцу табл. 1.

Реакция с йодом Троммера

Без фермента (контроль с водой)

1. Йодокрахмальная реакция. К полученному раствору (гидролизату) добавляют 1 — 2 капли 1 % раствора йода ( I 2) в 2 % растворе йодида калия (К I ). Отмечают изменение окрашивания содержимого пробирки.

2. Реакция Троммера. К полученному раствору (гидролизату) добавляют сначала 1 мл 10 % раствора гидроксида натрия (NаОН) для создания щелочной среды, а затем 1 мл 5 % раствора сульфата меди (С USO 4) И нагревают на кипящей водяной бане. Наблюдается ли изменение окрашивания? Будет ли положительной проба Троммера?

Сделать вывод, прошел ли гидролиз крахмала. Что образовалось в результате гидролиза? Привести в отчете ступенчатую схему ферментативного гидролиза крахмала.

Опыт 2. Влияние температуры на активность ферментов

Ферменты очень чувствительны к температуре и проявляют свою наивысшую активность при ее оптимальном значении, которое для ферментов человека составляет 35 — 45 °С. При температуре более 50 °С активность ферментов падает, а затем наступает их инактивация, так как структура активного центра фермента нарушается, и не происходит его соединения с субстратом.

Берут две чистые, сухие пробирки, нумеруют их. В обе пробирки вносят по 10 капель 1 % раствора крахмала. Затем в одну пробирку добавляют 5 капель раствора слюны в разведении 1:5, а в другую — такое же количество предварительно прокипяченной в течение 10 минут слюны (амилаза инактивирована). Обе пробирки встряхивают и помещают в термостат с заданной температурой 37 °С на 15 минут, после чего проверяют, прошел ли гидролиз крахмала в каждой из пробирок. Для этого с содержимым каждой пробирки проделывают реакцию с раствором йода (йодокрахмальную) и реакцию Троммера. Результаты опыта заносят в табл. 2.

Прокипяченная амилаза слюны

В отчете указать, в какой пробирке прошел гидролиз крахмала, а в какой — нет, и почему.

Опыт 3. Влияние рН среды на активность фермента

Для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет наивысшую активность. Изменения рН замедляют или полностью тормозят действие ферментов, так как при этом происходит нарушение структуры активного центра (при изменении реакции среды изменяется заряд функциональных групп, входящих в состав активного центра).

В восемь пронумерованных пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. Затем в пробирку № 1 добавляют 1 мл 0,2 % раствора соляной кислоты (НСI), перемешивают и отбирают из нее 1 мл полученной смеси, которую переносят в пробирку № 2. Содержимое пробирки перемешивают, отбирают 1 мл и переносят в пробирку № 3 и т. д. Из пробирки № 8 отбирают 1 мл содержимого и выливают его. Таким образом, получаются различные разведения соляной кислоты, которые соответствуют различным значениям рН среды.

Читайте так же:  Возможно ли рефинансирование кредита с текущими просрочками

После этого в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1 % раствора крахмала и по 1 мл раствора слюны в разведении 1:10. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 15 минут при 37 °С. Вынутые из термостата пробирки охлаждают и добавляют в каждую из них по 1 капле 1 % раствора йода ( I 2) в 2 % растворе йодида калия (К I ).

В отчете указать, как изменяется окрашивание содержимого в каждой пробирке, и отметить, что полный гидролиз крахмала произошел в пробирках № 5 и № 6, где рН = 6,8 — 7,2, что является оптимальным для действия амилазы.

Опыт 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

Одни вещества могут усиливать действие ферментов (активаторы), а другие — тормозить их активность (ингибиторы). Для амилазы активаторами являются анионы хлора, для липазы поджелудочной железы — желчные кислоты. Ингибиторами амилазы выступают ионы меди (II) — Си 2+ , а ингибиторами цитохромов (ферментов, участвующих в биологическом окислении) — цианиды и т. и.

Берут три сухие, чистые пробирки, нумеруют их. В пробирку № 1 вносят 1 каплю 3 % раствора хлорида натрия (NаС O ). в пробирку № 2 — 1 каплю 1 % раствора сульфата меди (Си SO 4), а в пробирку № 3 — 1 каплю воды (контроль). Затем во все пробирки добавляют по 10 капель слюны в разведении 1:5. Содержимое каждой пробирки перемешивают, вносят в каждую пробирку 5 капель 1 % раствора крахмала и оставляют на 5 минут при комнатной температуре. После этого во все пробирки добавляют по 1 капле 1 % раствора йода ( I 2) в 2 % растворе йодида калия (К I ).

В отчете указать:

1) как изменилась окраска раствора в каждой пробирке;

2) в каких пробирках прошла реакция гидролиза крахмала, а в каких — нет.

По результатам наблюдений сделать выводы об активирующей или ингибирующей способности растворов исследуемых солей.

Опыт 5. Белки как противоядие для ионов тяжелых металлов

Взаимодействие ионов металлов с белками лежит в основе использования молока как противоядия при отравлении организма человека тяжелыми металлами.

Берут две сухие, чистые пробирки, нумеруют их. В опытную пробирку № 1 наливают по 1 мл раствора амилазы, 1 % раствора крахмала, 1 % раствора ацетата свинца (II) — (Ас)2Р b и молока. В контрольную пробирку № 2 наливают по 1 мл растворов амилазы, крахмала, ацетата свинца (II) и воды. Пробирки встряхивают и выдерживают в термостате 20 минут при температуре 30 °С. Добавляют в обе пробирки по 1 капле 1 % раствора йода ( I 2). В обеих пробирках есть ионы свинца (Р b 2+ ), инактивирующие амилазу. Но в присутствии молока активность амилазы сохраняется, о чем свидетельствует отсутствие синего окрашивания раствора при добавлении раствора йода (отрицательная реакция, так как крахмал гидролизовался).

В отчете указать, как изменилась окраска раствора в каждой из пробирок и почему.

Опыт 6. Обнаружение каталазы в пищевых продуктах

Фермент каталаза содержится в некоторых сырых продуктах — молоке, мясе, картофеле и др. Каталазу обнаруживают, используя ее способность разлагать перекись водорода с выделением газообразного кислорода:

Берут две сухие, чистые пробирки, нумеруют их. В обе пробирки вносят по 5 капель перекиси водорода (Н2 O 2). В первую пробирку добавляют 5 капель сырого молока, во вторую — 5 капель кипяченого. В первой пробирке происходит выделение газа, заставляющее вспыхивать поднесенную тлеющую лучинку, во второй этого не происходит. Вместо молока можно взять кусочки сырого и вареного мяса или сырого и вареного картофеля.

В отчете указать, в какой пробирке наблюдалось выделение газа, и сделать вывод о наличии каталазы в исследуемых продуктах питания.

Опыт 7. Обнаружение тирозиназы в картофеле

Тирозиназа (катехолоксидаза) относится к группе ферментов, окисляющих фенолы и родственные им соединения, в частности тирозин. По химической структуре тирозиназа является металлопротеидом, содержащим медь в количестве 0,20 — 0,25 %. Медь служит переносчиком электронов от субстрата на кислород воздуха. Тирозиназа содержится во многих растениях, грибах, а также в отдельных органах и тканях животных.

Под влиянием тирозиназы тирозин окисляется до красного пигмента, а при дальнейшем окислении переходит в черный пигмент меланин. Превращение красного пигмента в меланин может протекать и в отсутствие тирозиназы, достаточно действия кислорода воздуха.

Для получения ферментного препарата тирозиназы сырой картофель очищают от кожуры, верхние слои клубня в количестве 2,0 — 4,0 г разрезают на кусочки, растирают в ступке с 10 мл дистиллированной воды и фильтруют через два слоя марли.

Берут две сухие, чистые пробирки, нумеруют их и в обе вливают по 1 мл полученного фильтрата. Содержимое одной пробирки кипятят 1 — 2 минуты и охлаждают под струей водопроводной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 0,1 % раствора тирозина, содержимое пробирок перемешивают и помещают в водяную баню при 37 — 40 °С. Периодически пробирки энергично встряхивают для лучшего соприкосновения компонентов смеси с воздухом. Постепенно в одной пробирке под действием тирозиназы раствор темнеет за счет образования продуктов окисления черного цвета типа меланинов. В контрольной пробирке, где фермент инактивирован нагреванием, цвет жидкости не изменяется.

В отчете указать, как изменилась окраска в пробирках и почему.

Источник: http://lifelib.info/biochemistry/biochemistry_1/8.html

Ученые выяснили степень активности действия амилазы

Учёные выяснили степень активности действия амилазы на крахмал в зависимости от температуры. В 4 пробирки налили по 5 мл 5 % раствора крахмала. Через 10 минут в каждую пробирку капают по 0,5 мл разбавленной слюны и добавляют по 2 капли йода. Проанализируйте полученные данные и ответьте на следующий вопрос: зависит ли степень активности ферментов от температуры?


пробирки
Температура, °C Окраска с йодом Степень
активности
1 100 Нет Нет
2 4 Нет Через 20 минут не идёт
3 39 Проявившееся синее окрашивание со временем исчезает 6 минут
4 23 Проявившееся синее окрашивание со временем исчезает 11—12 минут

Да, т. к. при повышении температуры скорость реакции увеличивается. Но при 100 градусах реакция не идет, т. к. белок денатурировал.

Примечание: Йод является реакцией на крахмал. Исчезновение окраски раствора говорит о разложении крахмала.

Читайте так же:  Период неуплаты алиментов

Источник: http://bio11-vpr.sdamgia.ru/problem?id=530

Ученые выяснили степень активности действия амилазы

Ферменты — это обширная группа катализаторов белковой природы, ускоряющие протекание химических реакций и играющие колоссальную роль в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов. Суммируя, широкое разнообразие саморегулируемых биологических процессов, реакции преобразования вещества составляет материальную и энергетическую основу непрерывного процесса создания и разрушения белковых тел, то есть самой сущности жизни. Большинство ферментов обладают весьма высокой специфичностью действия по отношению к определенным веществам, или определенным типам химических связей. Так, амилаза слюны расщепляет гликозидную связь между 1-м и 4-м атомами углерода крахмала, но не действует на другой полисахарид — целлюлозу. В своем строении α-амилаза имеет ион кальция, который не только активирует молекулу, но и предохраняет от потери активности и гидролиза при действии протеолитических ферментов. Для взаимодействия молекул фермента и субстрата, на который воздействует фермент, необходимо участие неорганических ионов, они выступают в роли активаторов ферментов.

Для работы и поддержания общего состояния организма необходима энергия, которую мы получаем из пищи. Главный источник энергии в рационе питания человека являются углеводы, поэтому процесс переваривания и расщепления углеводов является жизненно необходимым. При анализе рациона питания, можно заметить, что еда современного человека слишком насыщена крахмалистыми веществами. Усваивание пищевых полисахаридов начинается с их гидролитического расщепления до моносахаридов. Расщепления углеводов идет под действием гидролитических ферментов, так называемых гликозидаз. Расщепления крахмала начинается в полости рта под действием α-амилазы слюны. Хорошо измельченная пища, обильно пропитанная слюной, благодаря этому легко переваривается и усваивается; от активности ферментов слюны зависит и здоровье всего пищеварительного тракта, а также качество дальнейшей переработки пищи. Нарушение ферментативной активности слюны ведет к нарушению углеводного обмена и, как следствие, снижению активности функции печени.

Слюна представляет собой прозрачную жидкость, выделяющуюся в ротовую полость тремя парами крупных слюнных желез и множеством мелких. Слюна смачивает полость рта, обеспечивает восприятие вкусовых ощущений, обвалакивает и склеивает размельченную пищу, формируя пищевой комок, что способствует глотанию. Помимо этого, слюна очищает ротовую полость, обладает бактерицидным действием, предупреждает повреждение зубной ткани. Состав представлен водой, в преобладающем количестве, муцином, ферментами α-амилазой, мальтозой, различные микроэлементами, катионами некоторых металлов, витаминами и другие ферментами.

Крахмал является одним из самых распространенных запасающих полисахаридов растений. Активно образуется в результате фотосинтеза, накапливается и откладывается в семенах, клубнях и других частях растений, используемых в пищу человеком. При кислотном гидролизе крахмал распадается с образованием глюкозы. Известно, что остатки глюкозы являются структурными компонентами молекулы крахмала. Вместе с тем процесс гидролиза в присутствии специфического фермента, ускоряющего гидролитического распада крахмала, приводит к образованию дисахарида мальтозы, при этом она не считается структурным компонентом молекулы крахмала. Природный крахмал состоит из двух фракций, отличающихся по своему строению и свойствам. Примерно пятая часть составляет амилоза, остальное приходиться на амилопектин. Название фракций отражает некоторые свойства веществ. Амилопектин с трудом растворяется в горячей воде, при этом образуется вязкий крахмальный клейстер и при дальнейшем охлаждении застывает в студнеобразную массу. Амилоза наоборот, хорошо растворима в теплой воде и не образует клейстера. Обе фракции крахмала дают окрашивание с раствором йода в йодистом калии, однако амилаза окрашивается в чисто синий цвет, а амилопектин – в фиолетовый.

Существует несколько методик для определения активности α-амилазы в биологических жидкостях, которые можно разделить на четыре основных группы. Редуктометрические (сахарифицирующие), основанные на исследовании образующихся из крахмала сахаров по редуцирующему действию глюкозы и мальтозы. Амилокластические, основанные на определении количества остатка нерасщеплённого крахмала: по степени интенсивности его реакции с йодом, эти методы более чувствительны и специфичны, или по вязкости суспензии крахмала. Хромолитические, основанные на использовании комплексов субстрат – краситель, которые под действием α-амилазы распадаются с образованием водорастворимого красителя. А так же методы, основанные на сопряженных ферментных реакциях, в которых активность фермента устанавливается по скорости накопления НАДФН.

Цель исследования – установить влияние хлорида натрия различных концентраций на активность амилазы слюны у курящих и не курящих студентов.

Материал и методы.

Работа выполнена с соблюдением этических принципов проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов, изложенных в Хельсинской декларации Всемирной Организации Здравоохранения. Все обследованные подписали информированное согласие на проведение исследования и обработку персональных данных. Для исследований был отобраны образцы слюны у 16 студентов, половина которых курит, другая половина не курит. Для определения активности α-амилазы слюны мы использовали амилокластический метод, основанный на оценки степени интенсивности реакции нерасщеплённого крахмала с йодом. Каждый образец слюны был разведен в 50 раз и по 1 мл добавлен в пять пробирок, в каждую из которых добавили по две капли раствора NaCl с концентрациями: 0,9%, 1%, 5,5%, 10% и 20% соответственно. Затем добавили 5 капель 1% раствора крахмала и через 2 минуты, при экспозиции комнатной температуры, по 1 капли раствора йода и перемешали. После этого производили оценку результатов.

Результаты исследований и их обсуждения.

Под действием амилазы крахмал гидролизуется с образованием продуктов не дающих цветной реакции с йодом. Интенсивность уменьшения окраски йод-крахмального комплекса в единицу времени прямо пропорциональна активности данного фермента. Данный метод оценки активности α-амилазы не требует токсичных реактивов, является недорогостоящим и простым в исполнении, может использоваться как скрининговый метод у людей, подвергающихся различным факторам риска: курение, токсическое действие профессиональных вредностей, частое употребление ксенобиотиков, проживание в неблагоприятных условиях среды [3]. Данные факторы риска, в частности табачный дым, снижают активность α-амилазы (таблица 1) [5]. Поскольку известно, что это многообразие факторов оказывает влияние на микробиоценоз ротовой жидкости, что приводит к формированию заболеваний ротовой полости (стоматиты, гингивиты, пародонтоз и даже рак гортани, языка) [2,4,7,8].

Таблица 1. Зависимость активности амилазы слюны от концентрации NаCl в еде у курящих и некурящих людей.

Видео (кликните для воспроизведения).

Источник: http://eduherald.ru/ru/article/view?id=19519

Ученые выяснили степень активности действия амилазы
Оценка 5 проголосовавших: 1

ОСТАВЬТЕ ОТВЕТ

Please enter your comment!
Please enter your name here